軟骨寡聚基質(zhì)蛋白（COMP）誘導(dǎo)C57BL/6的小鼠關(guān)節(jié)炎

背景簡介：
轉(zhuǎn)基因小鼠研究常用的品系是C57BL/6遺傳背景小鼠，由于缺乏該品系的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）可靠模型而限制了該品系在風(fēng)濕病研究中的的應(yīng)用。膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎（CIA）是最廣泛的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎動物模型，而C57BL/6小鼠由于具有MHC II類單倍型H-2b，其不能有效用于制備膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎（CIA）模型。
瑞典Vacara公司開發(fā)了一種用軟骨寡聚基質(zhì)蛋白（COMP）誘導(dǎo)C57BL/6小鼠關(guān)節(jié)炎模型。該蛋能夠在C57BL/6小鼠誘導(dǎo)高發(fā)病率的嚴(yán)重關(guān)節(jié)炎，并伴有強(qiáng)烈的自身抗體反應(yīng)。
關(guān)鍵詞：瑞典Vacara,類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、軟骨寡聚基質(zhì)蛋白（COMP）、Cartilage Oligomeric Matrix Protein、C57BL/6小鼠，轉(zhuǎn)基因
實驗動物：
COMP誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎可以在雄性和雌性小鼠中都可以進(jìn)行。如果使用雌性小鼠，應(yīng)該講它們放在一起一段時間，以同步它們的發(fā)情周期。如果使用雄性小鼠，特別重要的一點是在性成熟之前將其分組以避免相互攻擊。
在實驗中，所有小鼠必須年齡和性別匹配，隨機(jī)分為實驗組，實驗組混合在在籠中。用于造模的小鼠至少要9周齡。小鼠在標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)條件下飼養(yǎng)，優(yōu)先選擇SPF飼養(yǎng)設(shè)施，該設(shè)施具有12小時明暗循環(huán)的氣候控制環(huán)境，飼養(yǎng)在具有標(biāo)準(zhǔn)食物和隨意給水的籠中。實驗也在傳統(tǒng)動物房進(jìn)行，但是所有的可變條件（感染、通風(fēng)、光循環(huán)、喂養(yǎng)等）都需要詳細(xì)描述，因為這些條件變化可能會影響實驗結(jié)果。
模型誘導(dǎo)方案：
關(guān)節(jié)炎模型通過COMP 免疫小鼠誘導(dǎo)。將COMP（100ug/小鼠）與佐劑（CFA, #263810, BD Difco）或含有結(jié)核桿菌（0.5mg/ml）的CFA 1:1 等體積混合制備乳劑。制備乳劑最終100ul乳劑中含COMP 100ug。

初次免疫佐劑選擇（CFA或IFA）可能會影響疾病的嚴(yán)重程度。相對含有結(jié)核桿菌的（Mycobacterium Tuberculosis H37Ra）IFA,CFA（2mg/ml M.butyricum）會導(dǎo)致更嚴(yán)重的炎癥。
不管初次免疫的佐劑如何選擇，預(yù)計的發(fā)病時間都是相同的。加強(qiáng)免疫后預(yù)計出現(xiàn)更嚴(yán)重的炎癥(見圖1)。環(huán)境因素如小鼠的微生物菌群變化，可能會影響疾病的嚴(yán)重程度，可以通過選擇適合環(huán)境和實驗?zāi)康牡淖魟﹣砜刂啤?br />關(guān)節(jié)炎評分：
初次免疫2周開始，每周至少對小鼠進(jìn)行三次外周關(guān)節(jié)炎癥查看。對爪子關(guān)節(jié)炎的癥狀隨機(jī)觀察，對每個紅腫關(guān)節(jié)進(jìn)行盲評分。要定義為臨床關(guān)節(jié)炎，必須滿足兩個標(biāo)準(zhǔn)，即腫脹和發(fā)紅。因此，例如在活動性關(guān)節(jié)炎后仍然腫脹但不載觀察到紅斑的爪子不被評分或不認(rèn)為是關(guān)節(jié)炎。
臨床關(guān)節(jié)炎的評分結(jié)果是0-60分：根據(jù)關(guān)節(jié)炎疾病的嚴(yán)重程度，每只發(fā)炎的足趾或關(guān)節(jié)得1分，腳腕或腳踝發(fā)炎得1-5分，每只爪子得0-15分，每只小鼠最多得60分。典型的嚴(yán)重過程如圖1.所示。


圖1.COMP誘導(dǎo)C57BL/6小鼠具有高發(fā)病率和嚴(yán)重程度的關(guān)節(jié)炎。小鼠用COMP+CFA佐劑（n=7）或IFA+0.5mg/ml結(jié)核桿菌（n=6）免疫，第35天加強(qiáng)免疫。關(guān)節(jié)炎發(fā)病率（左側(cè)）和關(guān)節(jié)炎評分（右側(cè)）。
COMP誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎特征：
與人關(guān)節(jié)炎相似，COMP誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)中顯著的滑膜增生、炎癥細(xì)胞浸潤及軟骨和骨破壞。COMP誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎導(dǎo)致顯著的抗COMP  IgG, IgG1,IgG2b自身抗體反應(yīng)，與首次免疫使用的佐劑無關(guān)。在C57BL/6小鼠中，未觀察到顯著的抗II型膠原抗體反應(yīng)，這表明COMP特異性B細(xì)胞反應(yīng)。COMP反應(yīng)似乎是肽特異性的，因為很少有肽被認(rèn)為主要的自身抗體表位。
COMP僅以天然構(gòu)象誘導(dǎo)嚴(yán)重的臨床關(guān)節(jié)炎。變性的COMP免疫，只能導(dǎo)致輕微的關(guān)節(jié)炎，發(fā)病率低。然而，這良好總構(gòu)象都誘導(dǎo)抗COMP抗體反應(yīng)，但當(dāng)天然COMP用于免疫時，觀察到更強(qiáng)的抗COMP IgG、IgG1和IgG2b抗體反應(yīng)。結(jié)論是：構(gòu)象表位的抗體是致病性的，可以誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎，并且這些抗體可能是由COMP特異性細(xì)胞協(xié)助激發(fā)的。
檢測方法：
關(guān)節(jié)炎發(fā)生后，可以在蘇木精和伊紅染色后對關(guān)節(jié)炎急性組織學(xué)分析。抗COMP的血清抗體可以通過ELISA法測定，使用重組人COMP作為測定抗原。操作流程，用于檢測IgG，IgG1和IgG2b系列抗體及在C57BL/6小鼠典型結(jié)果在文獻(xiàn)3種有詳細(xì)描述。肽特異性T細(xì)胞活化可通過體外刺激脾細(xì)胞并通過ELISpot測定IFN-γ 分泌來測量，如文獻(xiàn)3所述。
優(yōu)勢：
COMP在C57BL/6小鼠中誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎小鼠模型CIA有許多相似之處，能夠誘發(fā)嚴(yán)重的多發(fā)性關(guān)節(jié)炎。該炎癥于MHCII類分子相關(guān)，T細(xì)胞識別的COMP衍生肽已被證實。與CIA一樣，T細(xì)胞對非自身蛋白抗原的反應(yīng)促進(jìn)了關(guān)節(jié)炎的誘導(dǎo)，因為免疫優(yōu)勢肽不能很好的與MHC II類分子結(jié)合，因此不能誘導(dǎo)耐受性。COMP免疫誘導(dǎo)強(qiáng)烈的抗體反應(yīng)，類似CIA中的II型膠原。
COMP誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎的主要優(yōu)點是：可以在攜帶H-2b單倍型的C57BL/6小鼠中誘導(dǎo)嚴(yán)重的關(guān)節(jié)炎。C57BL/6小鼠被認(rèn)為是免疫學(xué)研究的標(biāo)準(zhǔn)背景，并且大多數(shù)轉(zhuǎn)基因小鼠株都是在這個背景下建立的。對于COMP誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎，遺傳修飾的C57BL/6小鼠可用于關(guān)節(jié)炎實驗，而無需廣泛的回交。
COMP也可以誘導(dǎo)C3H背景表達(dá)A^q, A^p小鼠。因此，COMP誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎在許多小鼠品系中可用于研究關(guān)節(jié)炎，并且免疫反應(yīng)與人類RA直接相當(dāng)。COMP誘導(dǎo)的小鼠關(guān)節(jié)炎在雌性和雄性中都是可誘導(dǎo)的。此外，COMP可以誘導(dǎo)大鼠關(guān)節(jié)炎，與LEW,E3 或DA 背景的RT1u MHC單倍型相關(guān)。
局限性：
   COMP誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎在加強(qiáng)免疫后會誘發(fā)嚴(yán)重的關(guān)節(jié)炎，因此需要幾周的時間來實驗。另一方面，這種特征被認(rèn)為是一種優(yōu)勢，因為該疾病模型與人類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎具有相同的免疫特征和T細(xì)胞和B細(xì)胞依賴性機(jī)制。
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