壞死性凋亡：在合適的時間點使用合適的檢測

摘要： 

對壞死性凋亡的檢測而言，關鍵的挑戰(zhàn)在于將它與凋亡和壞死區(qū)分開。細胞很容易從凋亡轉到壞死性凋亡，反之亦然，而繼發(fā)性的壞死也往往發(fā)生在凋亡的后期階段。因此，細胞死亡的檢測要輔以實時的形態(tài)分析以及死亡通路的抑制或敲除。同時，找對采樣的時間點，這也很關鍵。 

在對壞死性凋亡（necroptosis）有了一定的了解之后，相信大家已經迫不及待要開始檢測了。其實，對壞死性凋亡的檢測而言，關鍵的挑戰(zhàn)在于將它與凋亡和壞死區(qū)分開。細胞很容易從凋亡轉到壞死性凋亡，反之亦然，而繼發(fā)性的壞死也往往發(fā)生在凋亡的后期階段。因此，細胞死亡的檢測要輔以實時的形態(tài)分析以及死亡通路的抑制或敲除。同時，找對采樣的時間點，這也很關鍵。

質膜完整性受損

大家都知道，利用非通透性的DNA結合染料（如DAPI、PI或7-AAD）能鑒定細胞死亡時的質膜完整性受損。當質膜破裂時，這些染料進入細胞并與DNA相結合，產生強烈的熒光。傳統(tǒng)的流式細胞儀和成像流式細胞儀能夠提供細胞大小和形態(tài)的信息，幫助區(qū)分活的、壞死和凋亡的細胞。在壞死性凋亡的早期階段，細胞腫脹導致前向和側向散射增加，但隨著質膜破裂和細胞內容物的滲漏而迅速減少。 

通過annexin V和PI的雙染色可將細胞分為健康（annexin V和PI陰性）、早期凋亡（annexin V陽性，PI陰性）以及晚期凋亡/繼發(fā)性的壞死和壞死性凋亡（annexin V和PI陽性）。分析形態(tài)上的差異，可進一步區(qū)分這些細胞（下圖）。壞死性凋亡的細胞顯示出彌散的PI染色和強烈的熒光信號，而經歷晚期凋亡/壞死的細胞則出現(xiàn)收縮。

細胞內含物檢測

細胞內含物的存在也可以說明組織和器官中的細胞死亡，比如乳酸脫氫酶（LDH）或線粒體DNA，但僅憑這些組分并不能說明細胞通過哪種途徑死亡。高遷移率族蛋白（HMGB1）、IL-1α、IL-33和親環(huán)素A的釋放可能表明壞死性凋亡發(fā)生，但這種現(xiàn)象也存在于巨噬細胞活化或全面凋亡中。因此，我們還是有必要通過延時視頻顯微鏡或透射電子顯微鏡來實時評估細胞形態(tài)，證實細胞的死因是壞死性凋亡。

羅丹明123、四甲基羅丹明甲酯（TMRM）、四甲基羅丹明乙酯（TMRE）以及JC-1等熒光探針都可以在具有完整膜電位（即非凋亡或非壞死）的線粒體中發(fā)出明亮的熒光。而在壞死性凋亡的早期階段，線粒體膜電位的超級化導致熒光瞬時增加。質膜破裂使膜電位消失，導致相應的熒光下降。這些數(shù)據(jù)可通過流式細胞儀、熒光顯微鏡或熒光讀板機測得。

形態(tài)上的變化

在經歷死亡這個過程時，細胞的形態(tài)是不斷變化的。因此，隨著時間的變化不斷測定，才能確認壞死性凋亡。延時視頻顯微鏡能夠將單個細胞的形態(tài)變化與分子、亞細胞和生化事件相關聯(lián)，從而區(qū)分壞死性凋亡和凋亡。PI等非通透性的DNA結合染料，可以確定質膜通透性，并區(qū)分壞死和壞死性凋亡。不過，大家最好優(yōu)化一下實驗，以避免光毒性，最大限度減少實驗誘導的細胞死亡。通常，減少暴露時間，降低光源電壓和相機上的像素合并都能減少細胞損傷的風險。

透射電子顯微鏡盡管耗時又昂貴，但通常被認為是評估形態(tài)的金標準，因為它能夠以高分辨率產生細胞形態(tài)的圖像。不過，制備過程可能會損害細胞形態(tài)，為此需要采用其他的方法來維持細胞完整性。Vanden Berghe等人曾在2013年提出一種方法，利用附著在組織培養(yǎng)板底部的巨噬細胞來捕獲瀕死的細胞。

抑制和敲除

廣譜的caspase抑制劑，如zVAD-fmk或Q-VD-Oph，往往被用來阻斷caspase激活，或證實壞死性凋亡的發(fā)生。盡管這些抑制劑能夠阻斷大部分的外部信號，但可能無法完全阻斷內部途徑，其中caspase的作用是在線粒體膜電位發(fā)生不可逆損失之后加速細胞死亡。

此外，人們也采用RIPK1抑制劑（necrostatin-1）和MLKL抑制劑（necrosulfonamide）來阻斷壞死性凋亡。不過，necrostatin-1可能在某些細胞中誘導細胞凋亡，并且在區(qū)分壞死性凋亡和凋亡上不夠特異。因此，需要額外的敲除策略來補充抑制實驗的數(shù)據(jù)。敲除RIPK3或MLKL可以阻斷壞死性凋亡，但也可能使細胞轉移到另外一條死亡途徑。因此，在敲除發(fā)生后分析細胞死亡的類型是很重要的。

當然，我們也可以利用western blot、免疫組化或流式細胞儀來檢測壞死性凋亡途徑中的關鍵蛋白質，比如RIPK3、RIPK1和MLKL，來支持形態(tài)學實驗結果。磷酸化MLKL（Ser358和Thr357）是最精確的蛋白，可確認壞死性凋亡是通過RIPK3介導的MLKL激活。此外，RIPK1/ procaspase-8的高比例也說明了環(huán)境有利于壞死性凋亡。

盡管壞死性凋亡是目前研究最透徹的程序性壞死，但其他受調控的細胞死亡也被確定，包括細胞焦亡（pyroptosis）、鐵死亡（ferroptosis）、parthanatos、親環(huán)蛋白D依賴的壞死等。這些通路并非孤立的，因此在未來研究程序性細胞死亡的通路時，有必要考慮通路之間的串擾和互作。如此看來，對于細胞是如何死亡的，即使是福爾摩斯也要動一番腦筋啊。